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定點敲入小(大)鼠

技術原理簡介

基因敲入(Knockin)鼠是指通過TALEN/CRISPR技術在目的序列位置引進特定的突變或外源基因的小鼠。通過針對基因靶序列設計相應的打靶質粒,然后根據(jù)需要插入的位置構建含Knockin片段或點突變的Donor質粒,將Donor質粒與打靶質粒共同顯微注射進小鼠的受精卵中,TALEN/CRISPR定位到基因組上的靶序列并切割雙鏈DNA,在隨后的修復過程中,細胞以含同源序列的Donor質粒為模版修復基因組DNA,最終獲得在目的DNA序列插入Knockin片段的Knockin小鼠。比如將報告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點,從而跟蹤目標基因的表達;也可以用報告基因取代大小鼠本身的基因,即:KO/KI同時發(fā)生。

TALEN/CRISPR構建定點敲入小(大)鼠技術流程圖

服務流程及周期

服務流程及周期圖

步驟    內容    周期
敲入元件獲得 客戶提供或全基因合成 根據(jù)實際情況而定
Cas9/gRNA的合成和同源模板(Donor)構建  合成Cas9/gRNA,檢測Cas9/gRNA活性,構建同源模板質粒  2個月
得到Founder Cas9/gRNA體外轉錄成mRNA和Donor質粒共同顯微注射受精卵,胚胎移植到代孕母鼠子宮,3周后出生,2周齡基因型鑒定。 2-3個月
得到F1代雜合子  2個月后性成熟,F(xiàn)ounder和野生型小鼠交配,3周后出生,2周齡基因型鑒定,獲得穩(wěn)定傳代的基因突變雜合子F1代。  3-4個月

 

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